A. Penyimpanan dan Penanganan Produk
- Sebelum pengujian produk, bagian luar wadah unit harus didesinfeksi sebelum dipindahkan ke tempat kerja atau LAF berfilter HEPA. Jika wadah produk tidak tertutup rapat, jangan merendam wadah produk dalam larutan disinfektan yang memungkinkan masuknya larutan bakterisidal ke dalam produk.
- Area kerja untuk membuka wadah unit harus berupa LAF berfilter HEPA atau lingkungan terkontrol alternatif untuk melindungi paparan media terbuka dan produk terhadap kontaminasi lingkungan atau personel.
- Jika sampel adalah produk berbahan dasar air, unit harus dikocok sebelum dipindahkan ke area kerja untuk memaksimalkan penyebaran mikroba.
- Semua pekerjaan selanjutnya dari tabung reaksi dengan produk atau subkultur dapat dilakukan di bangku kerja laboratorium atau di dalam Biological Safety Cabinet (BSC) jika jamur berfilamen dicurigai ada dalam sampel.
B. Persyaratan Berpakaian
Saat melakukan pengujian, analis harus mengenakan jas lab yang bersih, lengan steril dan sarung tangan steril. Sarung tangan harus sering didesinfeksi terutama saat membuka dan menangani unit sampel (produk). Bergantung pada jenis Laminar Flow Hood, mengenakan masker bedah dan jaring rambut juga mungkin bermanfaat.
C. Growth Promotion, Sifat Indikatif dan Penghambat Media
Uji setiap batch media siap pakai dan setiap batch media yang dibuat baik dari media dehidrasi atau dari bahan untuk promosi pertumbuhan dan jika sesuai, untuk sifat indikatif dan penghambatan, mengikuti USP <60>, <61> dan <62>. Pastikan bahwa kultur lot benih yang digunakan tidak lebih dari lima jalur yang diambil dari lot benih induk yang asli. Suspensi uji strain harus digunakan dalam waktu 2 jam, atau dalam waktu 24 jam jika didinginkan antara 2ºC dan 8ºC. Suspensi spora (A. brasiliensis, B. subtilis, dan C. sporogenes) didinginkan antara 2ºC dan 8ºC dapat disimpan untuk periode yang divalidasi. Jika suspensi bakteri atau jamur siap pakai yang tersedia secara komersial digunakan, maka petunjuk produsen harus diikuti sehubungan dengan persyaratan persiapan dan penyimpanan. Selain itu, semua suspensi bakteri dan spora harus disiapkan untuk menghasilkan ≤100 CFU. Pelat dan tabung promosi pertumbuhan (dan uji kesesuaian) tidak boleh diinkubasi dalam inkubator yang sama dengan yang digunakan untuk pengujian produk. Jika hal ini tidak dapat dihindari karena ruang yang terbatas, sebaiknya simpan \”sampel berduri\” di bagian bawah inkubator di bawah pelat dan tabung yang diinokulasi sampel.
D. Kesesuaian Metode Uji
Untuk suspensi strain uji yang disiapkan sendiri dari bakteri vegetatif dan ragi harus digunakan dalam waktu 2 jam, atau dalam 24 jam jika didinginkan antara 2ºC dan 8ºC. Suspensi spora (A. brasiliensis, B. subtilis, dan C. sporogenes) dapat disiapkan dan dipertahankan antara 2ºC dan 8ºC hingga tujuh hari. Selain itu, semua suspensi bakteri dan spora harus disiapkan untuk menghasilkan ≤100 CFU.
Organisme di bawah ini direkomendasikan untuk penggunaan ORS agar memiliki format lembar kerja yang konsisten dan standar:
USP <60>:
Burkholderia cepacian (ATCC 25416)
Burkholderia cenocepacia (ATCC BAA-245)
Burkholderia multivorans (ATCC BAA-247)
USP <61>:
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)
Staphylococcus aureus (ATCC 6538)
Bacillus subtilis (ATCC 6633)
Candida albicans (ATCC 10231)
Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404)
USP <62>:
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)
Staphylococcus aureus (ATCC 6538)
Escherichia coli (ATCC 8739)
Salmonella enterica (ATCC 14028)
Candida albicans (ATCC 10231)
Clostridium sporogenes (ATCC 11437)
USP <60>, <61> dan <62> masing-masing berisi kriteria penerimaan untuk uji kesesuaian masing-masing. USP <60> mensyaratkan bahwa mikroorganisme BCC harus dideteksi dengan reaksi yang ditunjukkan. Reaksi terindikasi ditunjukkan dengan tumbuhnya koloni coklat kehijauan dengan lingkaran cahaya kuning, atau koloni putih yang dikelilingi oleh zona pink-merah pada BSCA. Untuk USP <61> bagian Hasil dan Interpretasi mensyaratkan produk yang diinokulasi memiliki jumlah rata-rata organisme uji yang tidak berbeda dengan faktor lebih besar dari 2 dari kontrol yang tanpa bahan uji. Misalnya, jika jumlah kontrol adalah 80 CFU, jumlah yang dapat diterima harus lebih besar atau sama dengan 40 CFU. USP <62> membutuhkan mikroorganisme yang ditentukan untuk dideteksi dengan reaksi yang ditunjukkan.
E. Prosedur Uji
Gunakan prosedur umum berikut untuk menyiapkan dan menangani sampel.
- Analisis sampel sesegera mungkin setelah diterima. Periksa setiap unit secara visual untuk integritas wadah utama dan catat setiap penyimpangan. Jangan gunakan wadah produk jika telah rusak atau rusak tanpa persetujuan pengawas. Pengujian wadah yang terganggu atau rusak harus dievaluasi berdasarkan kasus per kasus. Diskusikan dengan penyelia jika wadah unit yang disusupi perlu diuji untuk tujuan forensik (yaitu perusakan produk).
- Identifikasi unit yang akan diuji dengan inisial, tanggal, nomor subsampel, dan nomor sampel Analis.
- Bersihkan permukaan luar wadah sampel dengan tisu steril menggunakan bahan antimikroba efektif yang telah divalidasi. Tempatkan pada baki atau permukaan yang telah didesinfeksi di tudung aliran laminar atau lemari biosafety yang telah didesinfeksi dengan benar. Biarkan wadah mengering.
- Buka wadah secara aseptik dan lakukan prosedur penimbangan di laminar flow hood atau lemari pengaman biologis jika memungkinkan.
- Kontrol lingkungan yang tepat seperti pelat pemaparan udara harus digunakan sesuai dengan prosedur mutu lokal.
- Kontrol negatif yang sesuai harus dijalankan bersamaan dengan sampel.
F. Interpretasi Hasil
USP <60>
Kemungkinan adanya Bcc ditunjukkan dengan tumbuhnya koloni coklat kehijauan dengan lingkaran cahaya kuning, atau koloni putih yang dikelilingi oleh zona merah jambu pada BCSA. Setiap pertumbuhan pada BCSA dikonfirmasi dengan tes identifikasi. Isolat harus diidentifikasi untuk genus dan, jika mungkin, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA. Produk memenuhi uji jika tidak ada pertumbuhan yang teramati atau jika uji identifikasi konfirmasi negatif.
USP <61>
Mengenai USP <61> kriteria penerimaan untuk kualitas mikrobiologi karena berkaitan dengan analisis kuantitatif memiliki variabilitas yang diperbolehkan dari unit pembentuk koloni akhir (CFU). Ada toleransi dua kali lipat dalam hasil akhir. Misalnya, jika monografi mensyaratkan batas 100 cfu/ml, batas atas yang dapat diterima untuk hasil ini adalah 200 cfu/ml. Informasi tambahan disertakan dalam bagian “Interpretasi Hasil” USP <61> yang harus dibaca dan dipahami saat meninjau hasil tes kuantitatif.
USP <62>
Gram-Negatif Bile-Tolerant
Produk sesuai dengan pengujian jika tidak ada pertumbuhan. Setiap isolat harus diidentifikasi berdasarkan genus dan, jika memungkinkan, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA.
Escherichia coli
Pertumbuhan koloni menunjukkan kemungkinan adanya E. coli. Hal ini dibuktikan dengan uji identifikasi. Isolat harus diidentifikasi untuk genus dan, jika mungkin, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA. Produk memenuhi uji jika tidak ada koloni atau jika uji identifikasi negatif.
Salmonella
Kemungkinan adanya Salmonella ditunjukkan dengan pertumbuhan koloni merah yang berkembang dengan baik, dengan atau tanpa bagian tengah berwarna hitam. Ini dikonfirmasi oleh tes identifikasi. Isolat harus diidentifikasi untuk genus dan, jika mungkin, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA. Produk memenuhi pengujian jika tidak ada pertumbuhan yang diamati atau jika tes identifikasi konfirmasi negatif.
Pseudomonas aeruginosa
Pertumbuhan koloni menunjukkan kemungkinan adanya P. aeruginosa. Hal ini dibuktikan dengan uji identifikasi. Isolat harus diidentifikasi untuk genus dan, jika mungkin, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA. Produk memenuhi uji jika tidak ada koloni atau jika uji identifikasi negatif.
Staphylococcus aureus
Kemungkinan adanya S. aureus ditunjukkan dengan tumbuhnya koloni berwarna kuning atau putih yang dikelilingi oleh zona kuning. Ini dikonfirmasi oleh tes identifikasi. Isolat harus diidentifikasi untuk genus dan, jika mungkin, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA. Produk memenuhi pengujian jika tidak ada pertumbuhan yang diamati atau jika tes identifikasi konfirmasi negatif.
Clostridium
Terjadinya pertumbuhan batang secara anaerobik dengan atau tanpa endospora, memberikan reaksi katalase negatif menunjukkan adanya Clostridia. Ini dikonfirmasi oleh tes identifikasi. Isolat harus diidentifikasi untuk genus dan, jika mungkin, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA. Produk memenuhi pengujian jika tidak ada pertumbuhan yang diamati atau jika tes identifikasi konfirmasi negatif.
Candida albicans
Pertumbuhan koloni putih dapat menunjukkan adanya C. albicans. Hal ini dibuktikan dengan uji identifikasi. Isolat harus diidentifikasi untuk genus dan, jika mungkin, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA. Produk memenuhi uji jika tidak ada koloni atau jika uji identifikasi negatif.
*Catatan: Mengenai USP <60> dan <62>, setiap isolat harus diidentifikasi berdasarkan genus dan, jika mungkin, spesies menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA.