PENGUJIAN EFEKTIVITAS ANTIMIKROBA

A. Media

Untuk kultivasi organisme uji, pilih media Agar yang mendukung pertumbuhan yang dari masing-masing kultur stok. Media yang direkomendasikan adalah Soybean Casein Digest Agar/Broth dan Sabouraud Dextrose Agar/Broth. Tambahkan inaktivator (penetral) yang sesuai untuk sifat antimikroba spesifik dalam produk ke dalam media Broth dan/atau Agar yang digunakan untuk prosedur pengujian bila diperlukan

B. Growth Promotion Media

Media yang digunakan untuk pengujian perlu dilakukan uji Growth Promotion dengan cara menginokulasi media dengan mikroorganisme yang sesuai. Mikroorganisme uji sebaiknya dipilih untuk uji Growth Promotion (Bagian D).

Media padat yang diuji untuk Growth Promotion harus disiapkan menggunakan metode yang akan digunakan untuk menganalisis produk (pour plate atau spread plate) untuk menentukan jumlah lempeng mikroba (CFU) yang harus ≥ 50% dari nilai perhitungan inokulum mikroorganisme.

C. Kesesuaian Metode Penghitungan dengan Adanya Produk

Untuk semua jenis produk, ikuti metodologi USP saat ini dengan petunjuk tambahan berikut:

Sebelum pengujian Efektivitas Antimikroba, tentukan apakah ada sifat antimikroba dengan melakukan pengujian Kesesuaian menggunakan mikroorganisme yang digunakan untuk pengujian produk (bagian D). Jika Uji Kesesuaian gagal, hasil uji Kesesuaian tidak valid dan perlu diulangi dengan modifikasi metode yang tepat untuk menetralkan sifat penghambat. Jika beberapa sampel dari produk yang sama dari produsen yang sama (jumlah dan bentuk yang sama) dikumpulkan, satu sampel dapat digunakan.

D. Organisme Uji

1. Candida albicans (ATCC No. 10231)
2. Aspergillus brasiliensis (ATCC No. 16404)
3. Escherichia coli (ATCC No. 8739)
4. Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027)
5. Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538)

E. Persiapan Inokulum

Inokulasi permukaan media agar yang sesuai dari biakan stok yang baru tumbuh dari masing-masing mikroorganisme uji di atas. Gunakan Soybean-Casein Digest Agar untuk Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 dan Staphylococcus aureus ATCC 6538 dan inkubasi pada suhu 32,5 ± 2,5° C selama 3 – 5 hari. Gunakan Sabouraud Dextrose Agar untuk Candida albicans ATCC 10231 dan Aspergillus brasiliensis ATCC 16404 dan inkubasi pada suhu 22,5 ± 2,5°C selama 3 – 5 hari untuk Candida albicans dan 3 – 7 hari untuk Aspergillus brasiliensis.

Biakan dipanen dengan mencuci menggunakan saline steril untuk mendapatkan jumlah mikroba sekitar 1×10⁸ CFU/mL. Untuk biakan A. brasiliensis ATCC 16404, gunakan salin steril yang mengandung 0,05% polisorbat 80. Sebagai alternatif, biakan dapat ditumbuhkan dalam media cair, yaitu Soybean Casein Digest Broth atau Sabouraud Dextrose Broth, (kecuali untuk biakan A. brasiliensis ATCC 16404) dan dipanen dengan sentrifugasi, pencucian dan penangguhan dalam saline steril untuk mendapatkan hitungan sekitar 1×10⁸ unit pembentuk koloni (CFU) per mL.

Perkiraan konsentrasi inokulum dapat diperoleh dengan prosedur turbidimetri untuk mikroorganisme penantang dan kemudian dikonfirmasi dengan jumlah lempeng. Dinginkan suspensi jika tidak digunakan dalam waktu 2 jam pada suhu 2-8°C. Tentukan jumlah CFU/mL di setiap suspensi menggunakan media yang sesuai dan waktu inkubasi pemulihan untuk mengkonfirmasi estimasi CFU/mL. Gunakan suspensi bakteri dan yeast dalam waktu 24 jam panen. Sediaan cetakan dapat disimpan di bawah pendingin (2-8° C) hingga 7 hari.

Catatan: Kultur standar alternatif yang tersedia secara komersial dapat digunakan sebagai pengganti kultur yang disiapkan sendiri.

F. Prosedur

Prosedur mengharuskan pengujian dilakukan dengan volume produk yang sesuai. Dianjurkan untuk memulai dengan setidaknya 20 mL produk. Gunakan wadah produk asli bila memungkinkan atau lima wadah bakteriologis tertutup yang steril dengan ukuran yang sesuai yang telah dipindahkan dengan volume produk yang sesuai. Jika produk yang diencerkan menunjukkan sifat antimikroba, penetral khusus mungkin perlu dimasukkan ke dalam pengencer atau media pemulihan. Untuk tujuan pengujian, produk telah dibagi menjadi empat kategori:

Kategori 1 – Injeksi, parenteral lainnya termasuk emulsi, produk otik, produk nasal steril, dan produk oftalmik yang dibuat dengan bahan dasar berair atau pembawa.

Kategori 2 – Produk yang digunakan secara topikal dibuat dengan bahan dasar atau pembawa berair, produk hidung non-steril, dan emulsi, termasuk yang diterapkan pada selaput lendir.

Kategori 3 – Produk oral selain antasida, dibuat dengan basa berair atau pembawa.

Kategori 4 – Antasida dibuat dengan basa atau pembawa berair.

Inokulasikan setiap wadah dengan salah satu inokulum yang telah disiapkan dan distandarisasi. Volume inokulum suspensi yang digunakan adalah 0,5% – 1,0% dari volume produk. Konsentrasi organisme uji yang ditambahkan ke produk untuk Kategori 1, 2 dan 3 sedemikian sehingga konsentrasi sediaan uji segera setelah inokulasi adalah antara 1×10⁵ dan 1×10⁶ organisme pembentuk koloni (CFU) per mL produk. Jika tidak ditemukan zat atau metode penetral yang sesuai dan kesesuaian metode memerlukan pengenceran yang signifikan, tingkat inokulum yang lebih tinggi (mis., 107-108) dapat digunakan sehingga reduksi unit log 3 dapat diukur. Untuk produk kategori 4 (antasida), konsentrasi akhir organisme uji adalah antara 1×10³ dan 1×10⁴ CFU/mL produk.

Segera tentukan konsentrasi organisme hidup dalam setiap suspensi inokulum dan hitung konsentrasi awal CFU/mL dengan metode jumlah lempeng. Inkubasi wadah yang telah diinokulasi antara 22,5 ±2,5°C dalam lingkungan inkubator dan ambil sampel wadah pada interval yang ditentukan. Interval pengambilan sampel kontainer meliputi: Produk Kategori 1 diambil sampelnya pada 7, 14, dan 28 hari dan produk Kategori 2 – 4 diambil sampelnya pada 14 dan 28 hari. Catat setiap perubahan tampilan produk pada interval ini. Tentukan jumlah mikroorganisme hidup per mL yang ada pada masing-masing interval pengambilan sampel ini dengan metode jumlah lempeng menggunakan media dengan inaktivator (penetralisir) yang sesuai. Hitung perubahan nilai log10 dari konsentrasi per mL berdasarkan konsentrasi yang dihitung dalam CFU/mL yang ada pada awal pengujian untuk setiap mikroorganisme pada interval pengujian yang berlaku dan nyatakan perubahannya dalam bentuk reduksi log.

CATATAN: USP tidak memerlukan volume produk tertentu untuk ditambahkan ke masing-masing dari lima tabung steril. Direkomendasikan 20 mL/tabung digunakan untuk standarisasi pengujian untuk semua laboratorium oralit.

CATATAN: Semua hitungan cawan harus dilakukan dalam rangkap dua (2 cawan per pengenceran).

G. Interpretasi

Kriteria efektivitas mikroba terpenuhi jika kriteria yang ditentukan terpenuhi (lihat tabel di bawah ini). Tidak ada peningkatan apabila nilai tidak lebih tinggi 0,5 log10 dari nilai yang diukur sebelumnya.