PENGUJIAN STERILITAS (BAG. 2)

E. Metode Analisis

1. Perangkat

Semua perangkat dengan hanya jalur yang berlabel steril harus diuji jalur dengan Cairan D steril dan menguji Cairan D melalui filtrasi membran.

2. Inkubasi Media Uji Sterilitas

1. Inkubasi Fluid Thioglycollate (THIO) pada suhu 32,5 ± 2,5˚C. Jangan mengocok atau mengaduk media uji selama inkubasi atau selama pemeriksaan untuk meminimalkan aerasi broth.
2. Inkubasi Soybean-Casein Digest Broth (SCD) pada suhu 22,5 ± 2,5˚C. Putar dengan lembut, kadang-kadang dilakukan untuk meningkatkan aerasi media.
3. Masa inkubasi untuk THIO dan SCD:

• Tidak kurang dari 14 hari kecuali untuk produk yang disterilkan menggunakan radiasi pengion. Jika tabung tidak dibaca pada hari ke-14 karena hari libur atau akhir pekan maka catat hasilnya, walaupun positif, pada hari pertama yang tersedia untuk mengamati tabung.
• Waktu inkubasi tambahan mungkin diperlukan jika analis mengetahui proses sterilisasi selain panas atau filtrasi (misalnya 30 hari (minimal) untuk produk yang disterilkan menggunakan radiasi pengion). Ini untuk memungkinkan perbaikan DNA mikroorganisme yang terluka oleh radiasi pengion, jika ada, yang mungkin ada).

F. Analisis Alat Kesehatan (Contoh: Kapas Murni, Kasa, Jahitan, dan Perban Bedah)

Metode USP untuk analisis pembalut bedah/kapas/kasa (dalam paket) membutuhkan jumlah minimum 100 mg, untuk diuji di setiap media. Direkomendasikan bahwa seluruh unit harus diuji di setiap media untuk barang sekali pakai yang dikemas secara individual.

1. Kasa, Kapas Murni, Jahitan dan Perban Bedah

• Menggunakan wadah media sebesar guci liter menganalisis seluruh unit produk.
• Jika unit terlalu besar untuk wadah, analisis unit sebanyak yang dapat ditempatkan dalam wadah dan ditutup oleh media.

2. Komposisi Alat Kesehatan

• Perangkat dapat diuji dalam komposit (2 – 4 unit/komposit) selama memenuhi spesifikasi Bab 71 USP saat ini sehubungan dengan jumlah minimum unit uji dan jumlah minimum unit yang akan diuji. Semua unit gabungan harus memiliki nomor lot yang sama.
• Perangkat dapat digabungkan hanya jika berhasil lulus uji Kesesuaian Metode. Jika unit gabungan tidak lulus uji Kesesuaian Metode, maka produk tidak dapat digabungkan.

G. Sistem Kontrol

Tujuan dari sistem kontrol adalah untuk memastikan sterilitas, dalam batas yang ditentukan, dari semua barang, media, cairan pembilas, dan peralatan yang digunakan dalam uji sterilitas. Sistem kontrol yang akan menyertai semua analisis sterilitas diuraikan di bawah ini:

1. Kontrol Sistem

“Kontrol sistem” digunakan untuk mendemonstrasikan pemeliharaan integritas sampel selama semua manipulasi analitik. Peralatan apa pun yang bersentuhan dengan produk yang sedang dianalisis, bersama dengan manipulasi apa pun oleh analis, harus dikendalikan. Dengan demikian, semua peralatan, cairan, dan media biakan untuk “kontrol sistem” harus ditangani dengan cara yang menduplikasi, sedekat mungkin, manipulasi sampel aktual yang sedang dianalisis. Semua bahan yang digunakan sebagai kontrol sistem harus disterilkan oleh laboratorium analisis. Namun, metode sterilisasi tidak harus sama dengan produk, tetapi harus membuat bahan steril.

Pilihan pertama untuk kontrol sistem adalah produk aktual, jika tersedia cukup unit uji. Ketika perangkat medis yang rumit harus dikorbankan untuk merancang uji sterilitas yang sesuai, pertimbangkan untuk menggunakannya sebagai kontrol sistem setelah dibersihkan, dikemas ulang, dan disterilkan.

Ketika ada alternatif yang layak, unit produk tidak boleh dikorbankan untuk digunakan sebagai kontrol sistem jika hal ini akan mengurangi jumlah unit yang tersedia untuk pengujian sterilitas di bawah persyaratan USP atau persyaratan kebijakan ORS, kecuali sebagaimana diatur dalam paragraf sebelumnya. Jika menggunakan unit produk akan mengurangi subsampel yang diperiksa di bawah jumlah yang dipersyaratkan oleh kebijakan USP atau ORS, laboratorium penganalisis harus menyiapkan kontrol dari bahan selain unit produk sampel jika memungkinkan.

a. Filtrasi Membran: Corong filter dari sambungan sumber vakum pada setiap manifold yang digunakan dalam pengujian digunakan untuk kontrol sistem. Sebagai alternatif, jika sistem kanister tertutup digunakan untuk melakukan uji sterilitas, set kanister dari lot yang sama yang digunakan selama analisis harus digunakan untuk kontrol sistem.

1. Bahan yang Dapat Difilter (cairan, padatan terlarut, dll). Gunakan bahan yang mirip dengan produk yang diuji. Bahan kontrol harus memiliki volume yang sama, dan dikemas dengan cara yang sama seperti produk uji. Air Peptone yang disterilkan dengan filter dan diautoklaf (USP Fluid A) mungkin berguna untuk tujuan ini dalam banyak kasus.
2. Perangkat dengan Jalur Cairan steril. Gunakan tabung atau wadah lain yang dilengkapi dengan jarum, katup, konektor, dll., sebagai produk yang diuji. Gunakan USP Fluid D untuk menyiram lumens.

b. Bahan yang diuji dengan inokulasi langsung (perangkat, padatan tidak larut, dan bahan lain yang tidak dapat disaring) Gunakan bahan yang serupa dalam ukuran, bentuk, dan tekstur, dan dikemas serupa dengan produk yang diuji. Replikasikan fitur yang relevan dan tidak biasa sedekat mungkin yang dapat mencerminkan kredibilitas uji sterilitas. Dalam merancang “kontrol sistem” untuk pengujian sterilitas, kehati-hatian harus dilakukan untuk menduplikasi produk sampel untuk sebagian besar aspek, sedekat mungkin. Jadilah baru dan inovatif untuk memenuhi persyaratan ini dan membuat kontrol sistem bermakna.

2. Kontrol Peralatan

Semua item peralatan yang digunakan dalam analisis yang tercantum di bawah ini akan dikontrol secara individual. Satu item dari setiap lot peralatan autoklaf diuji di setiap media yang digunakan dalam pengujian. Oleh karena itu, untuk sampel yang diuji dalam THIO dan SCD, satu item dari setiap muatan alat sterilisasi (oven atau autoklaf) diuji di setiap media dengan memberikan total dua kontrol untuk setiap pinset, jarum suntik, dll., yang digunakan dalam pengujian: Forceps, Jarum suntik, Gunting, Pisau bedah, Penyeka, Pipet, Membran (kering, langsung dari kemasannya) jika membran disterilkan pada tempatnya kontrol ini dapat dihilangkan, Hemostat dan Item khusus lainnya yang mungkin diperlukan oleh tes tertentu.

3. Kontrol Cairan Media dan Bilas

Media yang tidak diinokulasi dan kontrol cairan bilas dianalisis untuk memastikan sterilitas pada saat digunakan. Alternatifnya, kontrol untuk bahan-bahan ini dilakukan sebagai bagian dari “kontrol sistem” untuk setiap manifold. Ini juga termasuk pemotong membran, dan item lain yang bersentuhan dengan produk tetapi tidak dapat dikontrol secara individual.

4. Kontrol Lingkungan

1. Kontrol Media Terbuka. Tabung dari masing-masing media (THIO dan SCD) yang digunakan dalam analisis sterilitas dipaparkan ke lingkungan sekitar pengujian (misalnya, laminar flow hood) selama pengujian berlangsung. Sebagai alternatif, laboratorium dapat menggunakan pelat pengendapan agar seperti yang dijelaskan di bagian b.
2. Piring Pengendapan Agar. Cawan Petri plastik yang mengandung media non-selektif yang efektif (berdasarkan persyaratan pengujian) dipaparkan di tudung untuk jangka waktu tidak lebih dari empat jam selama analisis. Setelah empat jam, pelat harus diganti untuk melanjutkan pemantauan (sebagaimana mestinya). Pelat harus diinkubasi selama 48 jam pada suhu 35˚C, dan tambahan 5 hari pada suhu 25˚C untuk mendeteksi kontaminasi jamur.
3. Kontrol dalam Isolator. Saat melakukan uji sterilitas di dalam isolator, jika telah dirancang untuk memungkinkan sambungan ke pengambil sampel udara dan penghitung partikel, pengambilan sampel ini dapat dilakukan selama durasi analisis sampel sebagai pengganti sampel lingkungan yang dijelaskan di atas. Jika isolator tidak dapat mengakomodasi alat pengambil sampel udara dan/atau penghitung partikel atau instrumen tidak tersedia, kontrol lingkungan yang dijelaskan pada bagian a dan b seharusnya digunakan. Sarung tangan isolator harus diperiksa sebelum dan sesudah sesi pengujian untuk memastikan integritas sarung tangan tetap terjaga. Pemeriksaan ini harus didokumentasikan. Selain itu, sebelum setiap siklus dekontaminasi, uji kebocoran sistem isolator harus dilakukan dengan hasil yang memuaskan.

5. Pemantauan Personalia

Pemantauan personel harus dilakukan setelah analis menyelesaikan pengujian sterilitas dan sebelum keluar dari ruang bersih aseptik. Analis harus menggunakan pelat sentuh media umum untuk memantau kondisi steril pakaian kamar bersih mereka dan untuk memastikan teknik aseptik diikuti. Misalnya, minimal lima pelat sentuh harus digunakan untuk tempat berpakaian personel berikut ini: Ujung jari sarung tangan RH, Ujung jari sarung tangan LH, Dada, Lengan Kiri, Lengan Kanan. Pelat sentuh media umum akan diinkubasi selama 5 hari pada suhu 30-35ºC.

CATATAN: Nilai numerik untuk batasan dan spesifikasi pemantauan personel ditetapkan berdasarkan tinjauan temuan aktual di dalam fasilitas. Semua isolat harus diidentifikasi dengan prosedur laboratorium setempat untuk memastikan bahwa analis tidak mengkontaminasi sampel. Analis harus membersihkan sarung tangan mereka selama analisis sterilitas dan mengganti sarung tangan bila diperlukan. Namun, mengganti sarung tangan sebelum melakukan pemantauan personel tidak dapat diterima. Setiap laboratorium diharuskan untuk memantau dan tren data untuk memastikan kepatuhan dan mendeteksi kelainan apapun.

H. Subkultur Media Primer

Pengamatan harian media uji primer (THIO dan SCD) yang mengandung produk harus dilakukan tanpa gangguan yang tidak perlu. Semua penanganan tabung positif, pelat bergaris, atau inokulasi selanjutnya dari media tambahan akan dilakukan di luar ruang bersih. Pemindahan kultur ini harus dilakukan di dalam kabinet biosafety berfilter HEPA atau yang setara di luar area ISO5 yang telah dibersihkan dengan bahan anti-mikroba sporisida/disinfektan yang efektif. Analis harus memakai setidaknya sarung tangan steril, lengan baju steril dan masker untuk meminimalkan kemungkinan kontaminasi silang.

1. Catat di lembar kerja Analis pada hari ketika media isolasi primer, Fluid Thioglycollate Broth (THIO), atau Soybean-Casein Digest Broth (SCD) menjadi keruh dan informasikan kepada pengawas. Guratkan tabung pada hari pertama tampak positif dan ulangi lagi pada hari ke-14 untuk menentukan adanya mikroorganisme lain yang mungkin tumbuh lambat (yaitu jamur).
2. Di dalam kabinet biosafety berfilter HEPA atau yang setara di luar ruangan bersih, goreskan tabung keruh ke Media Pencernaan Kasein Kedelai Modifikasi [kaldu SCD + agar 1,5%] (SCDA Modifikasi) atau pelat agar non-selektif lainnya.
3. Semua pelat bergaris diinkubasi untuk jangka waktu setidaknya selama diperlukan untuk pertumbuhan media isolasi asli (THIO atau SCD) tidak lebih dari tujuh hari.
4. Subkultur dari Cairan Thioglycollate Broth (THIO). Subkultur tioglikolat broth ke plate agar media umum dalam rangkap dua. Coret dua piring; inkubasi satu secara aerobik, dan satu secara anaerobik, masing-masing pada suhu 32,5 ± 2,5 ºC. CATATAN: Disarankan untuk mentransfer alikuot media dari dekat bagian bawah tabung untuk memaksimalkan pemulihan anaerob yang ketat. Catat jika ada pertumbuhan yang diamati pada pelat anaerobik yang berbeda dari pertumbuhan pada pelat aerobik. Pilih satu koloni perwakilan dan lakukan uji toleransi-aero untuk menentukan apakah anaerob yang ketat telah pulih. Lanjutkan dengan identifikasi semua anaerob ketat yang ditemukan saat isolasi selesai. Catat jika ada pertumbuhan yang diamati pada pelat aerobik dan bandingkan dengan pertumbuhan pada pelat anaerobik. Lanjutkan dengan identifikasi saat isolasi selesai.
5. Subkultur dari Soybean Casein Digest Broth (SCD). Sub kultur SCD broth ke media pertumbuhan umum dan diinkubasi secara aerobik. Coret satu piring; inkubasi secara aerobik pada suhu 22,5 ± 2,5 ºC. Perhatikan apakah ada pertumbuhan yang diamati pada pelat media pertumbuhan umum. Lanjutkan dengan identifikasi saat isolasi selesai. Setiap organisme harus diidentifikasi genus dan spesiesnya, jika memungkinkan, menggunakan kit identifikasi cepat atau pengurutan DNA.

I. Kekeruhan yang Diinduksi Produk pada Media Uji Primer

Ketika kekeruhan yang disebabkan oleh produk mencegah konfirmasi pengamatan visual pertumbuhan, petunjuk berikut berlaku:

1. Catat “T” untuk setiap subsampel yang keruh karena campuran produk-media.
2. Pada halaman observasi harian, tunjukkan arti “T” sebagai: “T = kekeruhan akibat produk”.
3. Pada akhir 14 hari awal inkubasi, pindahkan sebagian media (tidak kurang dari 1 ml) ke wadah baru dari media yang sama dan kemudian inkubasi wadah asli dan wadah yang dipindahkan selama tidak kurang dari 4 hari. Catatan: Ikuti edisi terbaru USP untuk setiap perubahan terkait subkultur dan inkubasi sampel keruh.
4. Periksa media yang diinokulasi produk asli dan media subkultur untuk pertumbuhan setiap hari bila memungkinkan selama tidak kurang dari 4 hari inkubasi dan catat hasilnya pada lembar lanjutan pengamatan harian yang baru.