PENGUJIAN STERILITAS (BAG. 1)

A. Uji Kesesuaian Metode

Kapan menjalankan Kesesuaian Metode:

a. Jalankan uji kesesuaian metode sebelum melakukan uji sterilitas sesuai dengan persyaratan USP dengan ketentuan sebagai berikut: Jika tidak cukup informasi tentang produk yang ada untuk menilai kemungkinan aktivitas penghambat pertumbuhannya.Dalam semua kasus, ketika tersedia waktu analitis yang cukup, yaitu sampel jenis survei.

b. Jalankan uji kesesuaian metode bersamaan dengan uji sterilitas produk saat waktu kritis, dan masalah yang terkait dengan 1. di atas telah teratasi. Namun, perlu dicatat bahwa jika Uji Kesesuaian Metode dijalankan bersamaan dengan uji sterilitas produk dan Uji Kesesuaian Metode harus gagal, hasil uji produk tidak valid dan Uji Kesesuaian Metode serta uji produk perlu diulang dengan modifikasi metode yang tepat untuk menetralkan sifat penghambat.

c. Jika jumlah produk yang dikumpulkan tidak mencukupi dan analisis kritis, uji kesesuaian dapat dilakukan pada akhir masa inkubasi 14 hari. Pastikan untuk menggunakan penilaian terbaik dan pendekatan netralisasi maksimum saat pertama kali melakukan uji sterilitas produk. Jika hasil kesesuaian menunjukkan penghambatan maka hasilnya, jika negatif, tidak valid. Namun jika hasil uji produk menunjukkan adanya mikroba dan uji kesesuaian menunjukkan daya hambat, maka hasil tersebut masih valid.

Prosedur Uji Kesesuaian Metode

Metode Uji kesesuaian dan kontrol kultur positif yang memerlukan penggunaan mikroorganisme hidup, harus dilakukan di luar ruang bersih atau isolator, dalam lemari biosafety atau yang setara.

a. Membran filtrasi

1. Lewati cairan produk melalui membran filter. Bilas membran dengan tiga porsi 100 ml (atau lebih jika ada) cairan pembilas yang ditentukan. Jangan melebihi siklus pencucian lima kali 100mL per filter. Langkah ini diharapkan akan menetralkan dan menghilangkan residu antimikroba pada membran filter.
2. Tambahkan organisme uji yang ditunjukkan dalam jumlah tertentu (kurang dari 100 CFU) ke dalam 100 ml cairan pembilas terakhir yang digunakan.
3. Saring cairan bilas dan secara aseptis potong membran filter menjadi dua bagian yang sama, pindahkan satu bagian ke masing-masing dari dua media yang sesuai. Jika melakukan uji sterilitas menggunakan sistem tabung tertutup, bilas setiap tabung dengan cairan pembilas yang telah diinokulasi.
4. Jika jumlah bejana uji yang tersedia tidak cukup untuk uji tantang lengkap untuk setiap mikroorganisme individu, maka organisme uji dapat digabungkan sesuai kebutuhan. Namun, konfirmasi pertumbuhan mikroorganisme komposit perlu dilakukan.
5. Konfirmasi mikroorganisme gabungan dengan pengecatan Gram, pemeriksaan mikroskopis, dan identifikasi setelah inkubasi selesai.
6. Lihat langkah c. di bawah untuk pertimbangan tambahan

b. Inolukasi Langsung

Untuk inokulasi langsung, tambahkan mikroorganisme uji ke bejana uji terpisah dari produk dan media biakan jika tersedia produk yang cukup. Lihat langkah c. di bawah untuk pertimbangan tambahan

c. Prosedur pengujian berikut berlaku untuk Inokulasi Langsung dan Filtrasi Membran

1. Inokulasi mikroorganisme yang sama menggunakan media yang sama tanpa produk sebagai kontrol positif.
2. Untuk bakteri dan jamur, inkubasi bejana uji sesuai dengan persyaratan USP. Pastikan bahwa kultur lot benih yang digunakan tidak lebih dari lima jalur yang diambil dari lot benih induk yang asli. Untuk suspensi strain uji yang disiapkan sendiri dari bakteri vegetatif dan ragi harus digunakan dalam waktu 2 jam, atau dalam 24 jam jika didinginkan antara 2ºC dan 8ºC. Suspensi spora (A. brasiliensis, B. subtilis, dan C. sporogenes) dapat disiapkan dan dipertahankan antara 2ºC dan 8ºC hingga tujuh hari. Selain itu, semua suspensi bakteri dan spora harus disiapkan untuk menghasilkan ≤100 CFU.
3. Jika pertumbuhan sebanding dengan bejana kontrol positif tanpa produk diperoleh, maka Anda dapat melanjutkan dengan uji sterilitas. Jika pertumbuhan yang terlihat sebanding tidak diperoleh, aktivitas antimikroba produk belum dihilangkan dalam kondisi pengujian. Ubah kondisi pengujian dan ulangi uji Kesesuaian Metode.

d. Jika produk ditemukan menunjukkan aktivitas penghambatan pertumbuhan ketika ditentukan bersamaan dengan pengujian produk, uji sterilitas harus diulangi menggunakan zat penetral (atau meningkatkan volume media) untuk memodifikasi kondisi guna menghilangkan aktivitas antimikroba.

e. Kultur yang digunakan untuk uji kesesuaian metode dapat dibeli secara komersial, siap pakai, atau dapat disiapkan dan dipelihara secara lokal. Salah satu prosedur memerlukan verifikasi kuantitatif dari CFU aktual yang diinokulasi pada saat digunakan.

B. Analisis Sampel

a. Wadah Sampel

1. Buka kemasan sampel luar di meja laboratorium yang telah didesinfeksi dengan zat antimikroba sporisida. Lihat literatur yang sesuai untuk memilih agen antimikroba yang sesuai untuk digunakan di fasilitas Anda.
2. Hitung jumlah unit yang diterima. Bandingkan angka ini dengan jumlah unit yang dikumpulkan.
3. Di dalam area persiapan ruang bersih yang terletak di luar area ISO 5 (jika tersedia) keluarkan semua kemasan luar dari unit subsampel yang akan diuji tanpa mengorbankan keutuhan produk yang steril. Hapus unit sampel dan letakkan di atas nampan atau gerobak yang didesinfeksi dengan agen antimikroba yang efektif. Catatan: Satu unit atau lebih dapat dikorbankan untuk membantu penentuan cara membuang bahan uji secara aseptis jika jumlah unit yang diterima mencukupi.
4. Periksa semua unit secara visual untuk integritas tutup wadah, untuk keberadaan benda asing dalam produk dan cacat tutup wadah lainnya. Catatan temuan pada lembar kerja analis.
5. Jika benda asing terlihat di dalam wadah utama, diskusikan dengan penyelia penggunaan prosedur ORS Dokumen ORA-LAB.015 berjudul “Protokol Penyaringan untuk Pewarnaan Langsung pada Produk dengan Penampilan Kontaminasi Terlihat” (lihat QMiS untuk Prosedur).

b. Identifikasi Sampel

Jika unit sampel tidak diidentifikasi oleh kolektor, analis harus mengidentifikasi unit dengan sampel #, inisial, tanggal, dan sub sampel # yang sesuai untuk ketertelusuran sampel. Jika tidak, beri tanggal dan inisial setiap unit.

c. Disinfeksi Kontainer Unit

1. Bersihkan bagian luar semua wadah utama produk menggunakan agen antimikroba/sporisida. Tergantung pada desain ruang bersih, segera pindahkan sampel ke ruang bersih pada troli baja tahan karat yang telah didesinfeksi atau tempatkan di dalam ruang bersih untuk persiapan akhir. Jika melakukan uji sterilitas dalam isolator, tempatkan sampel pada gerobak baja tahan karat yang ditunjuk. Biarkan sampel terpapar disinfektan untuk waktu yang tepat sebelum penanganan lebih lanjut. Semua unit harus didesinfeksi dengan tepat. Prosedur desinfeksi yang disarankan dapat dilakukan pada unit yang biasa ditemui sebagai berikut:

• Ampul dapat diseka dengan handuk / tisu steril bebas serat yang dibasahi dengan disinfektan. Ampul dapat direndam dalam desinfektan/sporisida mengikuti panduan pabrik atau SOP laboratorium.
• Vial tidak boleh direndam karena kemungkinan migrasi disinfektan di bawah penutup dan ke dalam produk.
• Paket Tyvek berlaminasi yang terdiri dari laminasi polietilen/plastik dapat didesinfeksi dengan handuk/tisu steril yang direndam dalam disinfektan. Bagian Tyvek digosok ringan dengan lap kering bebas partikel steril dan udara kering dalam tudung aliran laminar berfilter HEPA sebelum pengujian.
• Paket Kertas dapat didesinfeksi dengan sinar UV jika memungkinkan. Lap jika perlu dengan tisu kering bebas partikel steril dan udara kering seperti di atas.

2. Jumlah unit dan/atau jumlah produk yang diuji: Ikuti USP edisi terbaru untuk menentukan jumlah unit yang benar untuk diuji dan jumlah produk yang akan dianalisis dari setiap unit. Lebih baik menguji seluruh isi setiap unit jika memungkinkan. Ikuti kebijakan laboratorium jika memerlukan pengujian lebih banyak unit daripada yang dibutuhkan USP.

3. Jika jumlah unit yang dikumpulkan kurang dari persyaratan USP, diskusikan dengan pengawas laboratorium sebelum melanjutkan. Sampel yang dikumpulkan dalam situasi penyebab dapat dianalisis dengan jumlah unit yang kurang dari persyaratan USP.

C. Persiapan untuk Analisis

a. Persiapan Media dan Cairan Pembilas

Ikuti USP terkini saat menyiapkan media yang digunakan untuk analisis sampel. Media yang dibeli secara komersial juga dapat digunakan untuk analisis. Media yang disiapkan dan dibeli harus memenuhi persyaratan uji promosi pertumbuhan USP untuk aerob, anaerob, dan jamur. Media yang digunakan adalah:

1. Fluid Thioglycollate medium (FTM). Media ini harus disiapkan dalam wadah yang sesuai untuk memberikan rasio permukaan terhadap kedalaman sehingga tidak lebih dari setengah bagian atas media telah mengalami perubahan warna yang menunjukkan penyerapan oksigen pada akhir masa inkubasi. Jika lebih dari sepertiga bagian atas media telah memperoleh warna merah jambu, media dapat dikembalikan sekali dengan pemanasan sampai warna merah jambu hilang. Perawatan harus diambil untuk mencegah masuknya udara non-steril selama pendinginan.
2. Media Soybean Casein Digest (media SCD). Media ini harus diinkubasi dalam kondisi aerob
3. Media Alternative Thioglycollate. Jenis media ini harus diinkubasi dalam kondisi anaerobik.
4. Media untuk obat-obatan yang mengandung Penisilin dan Sefalosporin. Tambahkan jumlah Beta-laktamase steril yang cukup ke media untuk menonaktifkan efek antibiotik ini.
5. Mengencerkan dan membilas cairan. Bilasan cairan ini dapat disaring sebelum sterilisasi untuk menghindari penyumbatan membran filter selama pengujian.

b. Penyimpanan media

Untuk media yang disiapkan di laboratorium, jangan gunakan media untuk masa penyimpanan yang lebih lama dari yang telah divalidasi. Untuk media yang dibeli secara komersial, ikuti persyaratan penyimpanan dan tanggal kedaluwarsa yang direkomendasikan produsen.

c. Kualifikasi media

Lakukan tes berikut pada media yang disiapkan sebelum digunakan:

1. Sterilitas: Batch media dapat digunakan jika siklus sterilisasi divalidasi dan dipantau dengan menggunakan indikator biologis, dan bets melewati pengujian kontrol kualitas lainnya. Juga, jika memungkinkan, sebelum sebaliknya secara bersamaan, inkubasikan sebagian media pada suhu yang ditentukan selama 14 hari.
2. Tes promosi pertumbuhan; ikuti USP saat ini dengan menggunakan strain organisme yang direkomendasikan (Tabel 1, USP <71>). Jangan menggunakan biakan yang lebih dari lima pasase yang dibuang dari lot benih induk asli. Kultur suspensi stabil yang disiapkan secara komersial dan standar dari organisme yang direkomendasikan juga dapat digunakan. Strain uji suspensi bakteri vegetatif atau ragi harus digunakan dalam waktu 2 jam, atau dalam 24 jam jika didinginkan antara 2ºC dan 8ºC. Suspensi spora (A. brasiliensis, B. subtilis, dan C. sporogenes) didinginkan antara 2ºC dan 8ºC dapat disimpan untuk jangka waktu yang telah divalidasi. Jika menggunakan organisme yang disiapkan secara komersial, ikuti instruksi dari pabriknya. Selain itu, semua suspensi bakteri dan spora harus disiapkan untuk menghasilkan ≤100CFU. Semua jumlah bakteri harus diverifikasi pada saat digunakan.

d. Persiapan peralatan

Peralatan analitik dan alat yang digunakan dalam analisis sterilitas dan kesesuaian hendaklah dibersihkan dan disterilkan menggunakan prosedur sterilisasi yang tervalidasi. Peralatan dan alat yang dibeli secara komersial harus diberi label steril dan disertai dengan sertifikat analisis sterilitas.

D. Aktifitas Ruang Bersih

a. Gaun

Personil sangat penting untuk pemeliharaan asepsis di lingkungan yang terkendali. Pelatihan menyeluruh dalam teknik aseptik diperlukan. Personil harus mempertahankan standar yang tinggi setiap kali mereka berurusan dengan produk steril.

1. Kualifikasi berpakaian personel harus dilakukan oleh setiap analis yang memasuki ruang bersih aseptik. Kualifikasi gaun personel harus terdiri dari:

• Pelatihan teknik gowning oleh pelatih yang berkualifikasi
• Pengamatan peserta pelatihan oleh pelatih saat berpakaian
• Pelat sentuh media pertumbuhan umum digunakan untuk menganalisis apakah peserta berpakaian dengan benar tanpa mengotori gaun luar steril, sarung tangan steril, dan penutup kepala steril.

2. Beberapa pertimbangan harus diambil sebelum memasuki ruang bersih (lihat di bawah). Ikuti prosedur khusus yang berlaku untuk fasilitas tersebut, antara lain:

• Pakaian yang tepat segera sebelum masuk ke ruang bersih diperlukan oleh semua personel tanpa kecuali.
• Lulur kamar bersih tanpa serat yang menutupi kulit sebanyak mungkin adalah pakaian dalam yang ideal untuk dipakai sebelum berdandan untuk ruang bersih aseptik. Pakaian jalanan tidak diizinkan.
• Hapus perhiasan dan riasan.
• Gosok tangan (dan lengan jika memungkinkan) sebelum berpakaian.
• Komponen seragam steril yang tidak terlepas harus digunakan sepanjang waktu.
• Gunakan prosedur gaun aseptik untuk mengenakan komponen seragam yang steril.
• Perawatan harus diambil untuk memilih gaun yang tidak memaparkan kulit ke lingkungan ruang bersih aseptik, Sporisida/disinfektan yang tepat digunakan untuk membersihkan sarung tangan.
• Jika memungkinkan, tempelkan prosedur berpakaian di ruang atau area ganti untuk membantu individu mengikuti urutan berpakaian yang benar.
• Jika seorang analis merasa perlu untuk meninggalkan ruangan, dia harus membuang semua komponen pelapis dan memakai yang baru saat masuk kembali.
• Jika seseorang yang dijadwalkan memasuki ruang bersih untuk analisis merasa sakit atau kulitnya bermasalah, dia harus berbicara dengan penyelianya untuk menunda masuk ke ruang bersih sampai benar-benar sembuh.

b. Persiapan Sampel

Ulangi prosedur disinfeksi menggunakan disinfektan/sporisidal yang tepat segera sebelum menempatkan wadah utama produk dalam tudung aliran laminar bersertifikat yang berfungsi. Biarkan semua wadah yang telah didesinfeksi mengering sepenuhnya di tudung aliran laminar sebelum dibuka untuk analisis. Cara lainnya, jika melakukan pengujian di isolator, tempatkan item yang telah didesinfeksi ke dalam isolator dan lanjutkan dengan prosedur lokal untuk dekontaminasi bagian dalam isolator yang benar.

c. Pembersihan Kamar Setelah Analisis

1. Keluarkan tabung media yang telah diinokulasi dan semua kontrol dari area analitik dengan meletakkannya di pass-thru atau pada gerobak baja tahan karat yang digunakan untuk mengangkut bahan masuk dan keluar dari ruang bersih.
2. Setelah analisis, semua wadah sampel, pembungkus peralatan, peralatan dan perkakas bekas harus dikeluarkan dari ruang bersih sebelum analis keluar.
3. Wadah sampel yang digunakan dalam analisis harus dikembalikan ke wadah luar aslinya untuk disimpan sebagai bagian dari sampel cadangan.
4. Disinfeksi area kerja sebelum keluar dari ruangan bersih.

d. Disinfeksi ruangan bersih dan pemantauan permukaan harus dilakukan untuk mikroorganisme aerob dan anaerob secara rutin. Frekuensi akan ditentukan oleh kebijakan laboratorium setempat.